Interférence potentielle et stratégies de gestion du HEPES sur le développement de la couleur de l'indicateur rouge de phénol

Dans les cultures cellulaires et les expériences biologiques,Puffer HEPESLe premier est utilisé pour maintenir la stabilité du pH dans le milieu de culture, tandis que le second est utilisé pour afficher visuellement les changements de pH.l'interaction entre les deux en termes de propriétés chimiques peut entraîner des anomalies de couleurCet article analysera les causes de ce phénomène et fournira des solutions d'optimisation simplifiées.

Base chimique de l'interférence de couleur

Le rouge phénolique est un colorant sensible au pH qui change de couleur en fonction de l'acidité ou de l'alcalinité: il apparaît jaune dans les environnements acides (pH < 6,8), rouge dans les environnements neutres (pH ≈ 7,4),et rouge violet dans les environnements alcalins (pH> 8Cette caractéristique en fait un outil idéal pour la surveillance du pH des milieux de culture cellulaire.

La fonction principale du HEPES en tant que tampon est de stabiliser le pH en libérant ou en absorbant des ions hydrogène.Le problème est que les groupes d'acide sulfonique dans les molécules HEPES ont une structure chimique similaire à celle du phénol rouge, et lorsque la concentration de HEPES est élevée, ils interagissent avec le phénol rouge pour modifier sa structure moléculaire.Ce changement provoque la couleur du phénol rouge pour devenir plus claire ou le changement à un pH spécifique, par exemple, il peut apparaître rouge orange au lieu du rouge standard à pH 7.4.

La manifestation intuitive du phénomène d'interférence

En culture cellulaire conventionnelle, si des concentrations élevées d'HEPES (par exemple supérieures à 20 mmol/L) et de phénol rouge sont utilisées simultanément, la couleur du milieu de culture peut être plus claire ou jaunâtre que prévu..Par exemple, le milieu de culture au pH 7,4 qui aurait dû apparaître en rouge a peut-être pris un orange pâle en raison de l'interférence du HEPES, ce qui a conduit les chercheurs à juger à tort la valeur du pH.

Dans l'observation par microscopie à fluorescence, cette interférence est plus prononcée.entraînant une diminution de la luminosité de l'image ou une augmentation du bruit de fondCet effet est particulièrement important dans les expériences d'observation à long terme ou d'imagerie de cellules vivantes, qui peuvent masquer le véritable état des cellules.

Plan d'optimisation simplifié

Ajustez la concentration de HEPES

1La culture conventionnelle: contrôler la concentration de HEPES dans les 10 à 15 mmol/L, ce qui a une interférence minimale avec le développement de la couleur du rouge phénol et peut maintenir efficacement la stabilité du pH.

2Expérience à court terme: si la durée de l'expérience est courte (par exemple < 4 heures), la concentration de HEPES peut être réduite à 5 mmol/l ou ajoutée uniquement en cas de besoin.

3. Cellules sensibles: pour les cellules extrêmement sensibles aux changements de pH (tels que les neurones), il est recommandé d' utiliser un système tampon au bicarbonate au lieu de HEPES ou d' éliminer complètement le phénol rouge.

Méthodes de rendu des couleurs alternatives

1. milieu de culture sans phénol rouge: pour les expériences nécessitant des concentrations élevées de HEPES, un milieu de culture sans phénol rouge peut être sélectionné,et des bandelettes de test de pH ou des pH-mètre électroniques peuvent être utilisés pour surveiller l'acidité et l'alcalinité.

2Les sondes fluorescentes: en utilisant des colorants fluorescents tels que BCECF-AM au lieu du rouge phénol, ces sondes ne sont pas affectées par l'interférence HEPES et peuvent fournir des mesures de pH plus précises.

3. Correction de la couleur: si l'HEPES et le rouge phénol doivent être utilisés simultanément, une courbe standard peut être préparée à l'avance pour corriger l'écart de couleur observé par la méthode colorimétrique.

Optimisation de la conception expérimentale

1. tamponnage par étapes: utiliser HEPES pour maintenir le pH pendant la phase de pré- culture des cellules, et passer à un milieu de culture sans HEPES avant l'imagerie pour réduire les interférences.

2. Sélection des longueurs d'onde: dans l'imagerie par fluorescence,éviter la longueur d'onde d'absorption principale du rouge phénol (comme 560 nm) et choisir un canal de fluorescence de longueur d'onde plus longue (comme 633 nm) pour réduire les interférences de fond.

3. réglage de contrôle: un groupe de contrôle sans HEPES a été mis en place pour chaque expérience afin de comparer visuellement les différences de couleur.

En comprenant le mécanisme d'interaction entre le HEPES et le phénol rouge,Les chercheurs peuvent facilement ajuster les conditions expérimentales pour assurer la fiabilité des résultats de développement des couleurs tout en maintenant la stabilité du système de culturePour les expériences complexes, il est recommandé de réaliser d'abord des expériences préliminaires à petite échelle pour vérifier l'efficacité du schéma d'optimisation.

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