Application of TRIS Buffer in Plasmid Extraction by Agarose Electrophoresis

Tris (Trihydroxyméthylaminométhane) est une base faible avec un pKa de 8,1 à température ambiante de 25°C et une plage tampon efficace de pH 7,0 ~ 9.2Le pH de la solution aqueuse de Tris alcali est d'environ 10.5L'acide chlorhydrique est généralement ajouté pour ajuster la valeur du pH à la valeur souhaitée, de sorte que le tampon de cette valeur de pH puisse être obtenu.L'ADN sera déprotoné dans une telle solution, améliorant ainsi sa solubilité. Si la solution acide ajustée au pH est remplacée par de l'acide acétique, on obtient un " tampon TAE " (Tris/acétate/EDTA),tandis qu'un " tampon TBE " (Tris/Borat/EDTA) est obtenu en le remplaçant par de l'acide boriqueCes deux tampons sont couramment utilisés dans les expériences d'électrophorèse des acides nucléiques.0) est principalement utilisé pour dissoudre l'ADN.(TE est une combinaison de Tris et EDTA.) 1MTris-HCl6.8 et 1.5MTris-HCl8.8 sont les réactifs les plus couramment utilisés pour le SDS-PAGE.

Réactif TRIS

Parmi les opérations conventionnelles de génie génétique, l'électrophorèse au gel d'agarose est la plus largement utilisée.identifier et purifier des fragments d'ADNIl utilise habituellement un dispositif d'électrophorèse horizontale pour l'électrophorèse sous un champ électrique à intensité et direction constantes.Les molécules d'ADN sont chargées négativement dans des tampons de gel (généralement alcalins) et migrent d'électrodes négatives vers positives dans un champ électrique.Le taux de migration des molécules d'ADN dépend de la taille et de la conformation de la molécule.L'influence de la force et de la direction du champ électrique, de la composition de base, de la température et des colorants incorporés,et ainsi de suite.

Opérationprocédé:

1 tampon TE: (10 mmol/L de Tris-HCl, 1 mmol/L de EDTA)

Puffer d'électrophorèse (50XTAE)

2 tampon d' électrophorèse (50XTAE): Tris 242g, acide acétique glaciaire 57,1 ml, EDTA (0,5 mol/ L pH 8,0) 100 ml

Diluer 50 fois avec de l'eau distillée lorsqu'il est utilisé.

3 Puffer d'échantillon (6X): bleu bromophénol à 0,25%, bleu xylène à 0,25%, saccharose à 40% (W/V)

4 tampon STET (pH 8,0) (8% de saccharose, 0,5% de Triton, 50 mmol/L EDTA, 10 mmol/L Tris)

1) Mesurer 100 ml de solution d'électrophorèse TAE, ajouter 0,7 g d'agarose, bien mélanger, placer au four à micro-ondes, chauffer pendant 3 minutes, dissoudre complètement l'agarose.

2) Fermez la plaque électrophorétique propre et sèche avec du caoutchouc stérilisé et scellez le bord avec une petite quantité de solution d'agarose.Placez le peigne et régler la distance entre le bord inférieur du peigne et la plaque d'électrophorèse, généralement 1 à 2 mm est approprié.

3) Lorsque la solution d'agarose dissoute est refroidie à environ 50 °C, ajouter 5 M L de bromure d'éthidium et la concentration finale de bromure d'éthidium est de 1,0 m g/m L. Après mélange,verser la solution d'agarose dans la plaque d'électrophorèse et la maintenir immobile sans bouger.

4) Une fois que le gel est complètement solidifié (30-45 minutes à température ambiante), retirez doucement le peigne, retirez le ruban adhésif et placez le gel dans le tampon d'électrophorèse.

5) Dans le processus d'électrophorèse, une solution d'électrophorèse (1'TAE) a été ajoutée pour couvrir la surface du gel d'agarose avec une solution d'électrophorèse d'environ 1-2 mm.